本发明涉及新的μ-芋螺毒素肽、该μ-芋螺毒素肽的生物活性片段、它们的组合、和/或它们的变体。本发明还涉及它们在用于治疗或预防疼痛的药物组合物中的用途,和它们在制备麻醉药中的用途。
1.一种抑制电压敏感性钠通道的μ-芋螺毒素肽,其中,其氨基酸序列如SEQxa0IDxa0No2所示:pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-Cys[SEQxa0IDxa0No2]。
2.一种分离或纯化的核酸序列,该核酸序列为:i).编码权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽的核酸序列,ii).与i)互补的核酸序列。
3.一种药物组合物,该药物组合物含有药物有效量的权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽作为活性物质,该活性物质选择性地与制药学上可接受的载体、稀释剂、和/或辅药组合。
4.权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疼痛的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其中,所述疼痛为偏头痛、急性疼痛、持续性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、或伤害性疼痛。
6.权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗或预防与Nav1.4电压敏感性钠通道相关的病症的药物中的用途。
7.药物有效量的权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽在制备药物中的应用,该药物用于在接受需要麻醉的手术操作的患者中提供骨骼肌松弛。
8.根据权利要求7所述的应用,其中,所述μ-芋螺毒素肽作为眼科麻醉药被给药。
9.根据权利要求7所述的应用,其中,所述μ-芋螺毒素肽作为局部麻醉药被给药。
10.根据权利要求7-9中的任意一项所述的应用,其具有30分钟-48小时的麻醉作用。
11.药物有效量的权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽或药物有效量的权利要求3所述的药物组合物在制备局部麻醉药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其具有30分钟-48小时的麻醉作用。
13.一种麻醉药,该麻醉药含有权利要求3所述的药物组合物、或权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽。
14.根据权利要求13所述的麻醉药,其中,该麻醉药适于皮下施用、静脉内施用、皮内施用、肌内施用、腹膜内施用、鼻内施用、经皮肤施用、口腔途径施用。
15.根据权利要求14所述的麻醉药,其中,该麻醉药的形式为片剂、胶囊、锭剂、牙科糊剂、栓剂、吸入剂、溶液剂、软膏剂和胃肠道外长效药剂。
16.一种载体,该载体包括权利要求2所述的分离或纯化的核酸序列。
17.一种可植入的装置,该装置包括权利要求3所述的药物组合物、或权利要求1所述的μ-芋螺毒素肽。技术领域
本发明涉及新的μ-芋螺毒素肽、该μ-芋螺毒素肽的生物活性片段、它们的盐、它们的组合、和/或它们的变体。本发明还涉及它们在用于治疗或预防疼痛的药物组合物中的用途,和它们在制备麻醉药中的用途。
背景技术
芋螺属(Conus)的海生芋螺(conexa0snail)的毒液是生物活性成分的丰富且极多样的来源。世界范围可得到的芋螺物种超过800个,芋螺毒液表现为显示出类型广泛的生物学活性的天然存在肽的最丰富来源之一。芋螺肽以高度的亲和力及特异性靶向大量不同的分子实体,所述分子实体包括电压敏感离子通道、配体门控离子通道和G蛋白偶联受体(McIntosh等,1999;Olivera等,1985;Olivera等,1990)。在现存的所有芋螺肽中,仅一小部分已经通过分离、至精确分子靶的一级结构阐明而得到广泛地表征。不过,这个研究领域已经吸引了越来越多的关注,因为芋螺肽提供了用于剖析先前未表征的通道的新型而重要的工具。通过使用在初始生理靶上发挥作用的新药物,这还为全新的生物医疗应用提供了机会。这可以举例说明为发现并使用用于区分特定钙亚型的ω-芋螺毒素和进一步使用它们中的一种作为控制疼痛的药物(Prialtntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="43"/>)(Kerr和Yoshikami,1984;Olivera等,1984;Olivera等,1987)。μ-芋螺肽家族首个代表的公布出现在1983年,表征了显示肌毒活性的地纹芋螺毒素(geographutoxin)(Sato等,1983)。此后分离并鉴定出几种其它的μ-芋螺肽。迄今为止,已经表征了来自6个不同的芋螺物种(主要包括食鱼物种和一个食贝物种)的总计9种μ-芋螺肽。这些μ-芋螺肽全部展示出由序列中的半胱氨酸残基的保守位置所显示的共同一级结构。二硫键位于Cys1-Cys4、Cys2-Cys5和Cys3-Cys6之间。这种折叠产生约束性的三级结构,已经对μ-芋螺肽家族的几个代表进行了所述三级结构的研究(Hill等,1996;Keizer等,2003;Nielsen等,2002;Ott等,1991;Wakamatsu等,1992)。已经在众多研究中证实μ-芋螺肽或多或少地特异性靶向多种电压敏感性钠通道(Becker等,1989;Bulaj等,2005;Cruz等,1985;Cruz等,1989;Fainzilber等,1995;French等,1996;Safo等,2000;Sato等,1991;West等,2002)。无论靶向哪一种钠通道亚型,药理作用往往包括阻断通道传导性,使电压敏感性通道功能受到抑制。电压敏感性钠通道(Voltage-sensitivexa0sodiumxa0channel,VSSC)是对细胞通信非常重要的跨膜蛋白,因为它们产生动作电位并能够使其在大多数脊椎动物和无脊椎动物的可兴奋细胞中传播。目前已经鉴定了9种编码哺乳动物VSSC的基因(Yu和Catterall,2003)。根据VSSC对河豚毒素(TTX)(特别从河豚中分离的一种毒素)的敏感性,对VSSC进行了分类。受TTX阻滞的VSSC称作TTX-敏感性,而其它则是TTX-抗性通道。VSSC的每种亚型具有依赖于其细胞定位和组织定位的特异化的功能。VSSC在肌肉和神经的动作电位传导中具有重要作用,因此在麻醉中提供关键靶。药物如利多卡因或普鲁卡因通过抑制存在于感觉纤维中的VSSC而发挥作用(Scholz,2002)。然而,在全部纤维中没有出现相同的抑制作用,其原因是存在的众多VSSC亚型受所述药物的影响有差异。在这些亚型中,TTX-抗性VSSC亚型在疼痛传导中具有优势地位并且目前未特异性地被任何已知药物靶向。另外,利多卡因和普鲁卡因的持续时间短并且已证实其应用引起副反应或过敏,使得利多卡因和普鲁卡因难以在具体病例中用作麻醉药(anaesthesics)。在这种情况下,能够特异性地抑制TTX-抗性VSSC的化合物将表现出对疼痛进行控制的主要作用。作为实例,亚型Nav1.8有助于启动并维持痛觉过敏。在神经性疼痛的早期,在受损的初始传入神经元中,Nav1.8的表达降低,而在毗邻的神经元中,Nav1.8的表达水平得到维持(Decosterd等,2002;Gold等,2003)。然而,坐骨神经损伤两日后,在与C纤维相符的传导速率下,Nav1.8的表达存在显著上调,并且TTX-抗性复合动作电位成比例地增加(Gold等,2003)。这有力地支持了Nav1.8在神经性疼痛中的重要地位。VSSC因此代表其抑制或调节允许麻醉、止痛和疼痛控制的有用靶(Baker和Wood,2001;Julius和Basbaum,2001;Lee,1976)。数目众多的肽作为分离的μ-芋螺毒素从专利申请WOxa002/07678(犹他大学研究基金会(Universityxa0ofxa0Utahxa0Researchxa0Foundation)和Cognetix,Inc.)中获知。然而,该文献提供的对所述肽的描述是模糊的并且有时容易误解,以至于难以依赖该文献的内容。很大程度上,在该文献中描述的大部分肽似乎已经仅通过分子生物学技术、通过分离并克隆编码μ-芋螺毒素肽的DNA、翻译并测定毒素序列而鉴定。仅依赖于此类技术可能导致错误,因为自然界中可以因编码的肽的翻译后修饰而产生活性氨基酸残基,其中某些所述的活性氨基酸残基不能直接从核苷酸序列中找到。最近,专利申请WOxa02004/0099238(昆士兰大学(Thexa0Universityxa0ofQueensland))也公开了新的μ-芋螺毒素肽及其衍生物,它们在分析法和探针中作为神经元活性钠通道抑制剂(拮抗剂)的用途以及在治疗疾病(包括疼痛、癌、癫痫和心血管病)中的用途。该申请也公开这些新的μ-芋螺毒素肽在放射配体结合测定(RLB)中的用途。本领域技术人员将理解这些结果不表示μ-芋螺毒素的任何生物学活性,而仅表示结合作用,因为从文献中已知一些化合物(包括芋螺毒素)与它们的通道/受体位点结合,但无任何生物学活性(Fainzilber等,1994;Shichor等,1996)。此外,在这些结合实验中所显示的效力与体外(inxa0vitro)或体内(inxa0vivo)抑制效力不相关,因此使读者不了解任何潜在的生物学抑制效力。另外,仅在所提及的表达的VSSC通道上的抑制活性(IC₅₀)超过1-3μM,因而表明在离体(exxa0vivo)或体内制剂中使用时的浓度甚至更高。因此无论何时仍需要具有强效和长效生物学活性的新化合物用作麻醉药,该新化合物具有优异的安全性能,仅有少量副作用或没有副作用,并且能够退降。该目标已经通过提供新的μ-芋螺毒素肽、其生物活性片段、其盐、其组合、和/或其变体而实现。本发明的作用持续时间长的肽可以用于制备麻醉药及治疗疼痛。
发明内容
本发明提供了一种μ-芋螺毒素肽,该μ-芋螺毒素肽基本上包括如下SEQIDxa0Noxa01所示的氨基酸序列、该氨基酸序列的生物活性片段、它们的组合、和/或它们的变体:Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17。另外,本发明提供了一种分离或纯化的核酸序列,该核酸序列包括编码本发明的肽的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还提供了一种药物组合物以及该药物组合物在制备用于治疗或预防与电压敏感性钠通道相关的疾病的药物中的用途,该药物组合物含有药物有效量的至少一种本发明的肽作为活性物质。本发明还提供了本发明的药物组合物在制备麻醉药中的用途以及该药物组合物在用于在接受需要麻醉的手术操作的患者体内提供骨骼肌松弛的方法中的用途。本发明的另一个方面涉及一种用于治疗或预防疼痛的方法。
附图说明
图1代表天然μ-芋螺肽CnIIIA的电喷雾离子化质谱(electrosprayionizationxa0massxa0spectrum)。质量测量在QTOFxa0I质谱仪上在阳离子模式和TOF-MS配置下实施。所示的质量为测得的单一同位素的分子质量。可以注意到CnIIIA的钾加合物;图2描述对合成的和天然的μ-芋螺肽CnIIIA的同一性的控制。图2A:通过合成肽、天然肽和两种肽的50∶50的混合物的反相高压液相色谱(HPLC)而进行的共洗脱实验。图2B:还原的合成CnIIIA(上部)以及还原的天然CnIIIA(下部)的MS/MS,显示相同的片段化性质;图3显示μ-芋螺肽CnIIIA对小鼠半膈(hemidiaphragm)收缩的作用。图3A:CnIIIA对通过直接刺激小鼠半膈所激发的肌肉收缩的作用。在不存在CnIIIA和存在100-600nMxa0CnIIIA的条件下记录的收缩迹线。图3B:CnIII对收缩的作用的剂量-反应曲线。对于CnIIIA的每个浓度,基于对照值来表述收缩的最大幅度。理论曲线根据所示方程式建立,希尔数(Hillxa0number)(n_H)是1.78,并且收缩被抑制50%所需要的CnIIIA浓度(K_D)是150nM。n次实验的平均值±SEM;图4显示在蛙皮胸肌(Cutaneousxa0pectorisxa0muscle)制备物上记录的μ-芋螺肽CnIIIA对动作电位和突触应答的作用。图4A:蛙皮胸肌上记录的CnIIIA对肌动作电位的作用:在1μMxa0CnIIIA施加至浴液之前或在施加之后的不同时间点记录的与运动神经刺激相对应的动作电位迹线和EPP。可以注意到肌动作电位的进行性阻滞。图4B:在蛙皮胸肌上记录的CnIIIA对突触应答的作用:在不存在CnIIIA和存在1μM及2μMxa0CnIIIA的条件下记录的MEPP平均迹线;图5代表μ-芋螺毒素CnIIIA对分离自小鼠的坐骨神经的整体动作电位(GAP)的作用。图5A:在对照条件(不添加毒素)下和用芋螺毒素CnIIIA的多种浓度(0.1-50μM)处理神经时强度在0.1-15V之间变化的0.05ms刺激响应的GAP记录。图5B:对不同强度的0.05毫秒刺激的响应和对不同浓度的CnIIIA毒素(左侧)的响应的GAP幅度。图5C:该表汇总了多种强度(0.1-15V)的0.05ms刺激后所记录的GAP的不同参数。⁽¹⁾在存在或不存在μ-芋螺毒素的条件下进行15V刺激后所记录的最大幅度之间的比值。⁽²⁾与15V刺激后最大幅度的50%相对应的刺激强度。n条坐骨神经的平均值±SEM;图6代表在芋螺毒素以多种浓度(0.1-50μM)存在的条件下记录的μ-芋螺毒素CnIIIA对小鼠坐骨神经的GAP的作用。在毒素的多种浓度(0.1-100μM)下所记录的GAP的最大幅度根据对照值进行表述。理论曲线根据以下等式计算:A_CnIIIA/A_C=1/[1+([μ-芋螺毒素CnIIIA]/K_D)n_H]。Hill数(n_H)是1.02,并且阻滞50%GAP所需要的毒素浓度(K_D)是1.53μM。n条坐骨神经的平均值±SEM;图7描述研究μ-芋螺毒素CnIIIA对分离自小鼠的坐骨神经的GAP的作用的可逆性。0.05毫秒刺激在对照条件下以多种强度(0.1-15V)作用于神经后记录GAP,0.05毫秒刺激以多种强度(0.1-15V)作用于用2、10或50μMCnIIIA毒素处理的神经或在新鲜哺乳动物林格氏溶液(Ringer’sxa0solution)中洗涤16小时或24小时的神经后记录GAP。n条坐骨神经的平均值±SEM;图8表示μ-芋螺毒素CnIIIA对分离自欧洲狗鱼(白斑狗鱼(Esoxxa0lucius))的嗅神经的整体动作电位(GAP)的作用。图8A:在对照条件(不添加毒素)下和用多种浓度(0.02-1μM)的芋螺毒素CnIIIA处理神经时,对强度在1-15V之间变化的8xa0ms刺激的响应的GAP记录。图8B:对不同强度的8ms刺激的响应和对不同浓度的CnIIIA毒素持续不同接触时间(左侧)的响应的GAP幅度。图8C:该表汇总了多种强度(1-15V)的8毫秒刺激后所记录的GAP的不同参数。⁽¹⁾在存在或不存在μ-芋螺毒素的条件下进行15V刺激后所记录的最大幅度之间的比值。⁽²⁾与15V刺激后最大幅度的50%相对应的刺激强度。n条嗅神经的平均值±SEM;图9显示在芋螺毒素以多种浓度(0.01-10μM)存在的条件下记录的μ-芋螺毒素CnIIIA对分离自欧洲狗鱼(白斑狗鱼)的嗅神经的GAP的作用,并相对与对照值进行表述。在毒素的多种浓度(0.1-100μM)的条件下所记录的GAP的最大幅度根据对照值进行表述。理论曲线根据以下等式计算:A_CnIIIA/A_C=1/[1+([μ-芋螺毒素CnIIIA]/K_D)n_H]。Hill数(n_H)是1.09并且阻滞50%GAP所需要的毒素浓度(K_D)是0.15μM。n条嗅神经的平均值±SEM;图10显示μ-芋螺毒素CnIIIA的表面麻醉作用及其与利多卡因的表面麻醉作用的比较。麻醉作用的强度表述为以所测试的每种浓度没有诱导出眼-眼睑反射的刺激的总数。数据代表6次不同测定的平均值±S.E.M;图11显示在小鼠体内得到的趾外展评分(DigitAbductionxa0Score,DAS);图12显示在小鼠体内得到的握力评估;图13显示通过40分钟温育后,与CnIIIA(100nM)相比,对每种肽(100nM)所测量的肌肉的相对平均收缩抑制。为便于比较,CnIIIA已经归一化至100%。所有肽SmIIIA、PIIIA和T3.1显示出的活性均比CnIIIA低;图14中,A:显示在500nMxa0CnIIIA的存在下,作为时间的函数的Nav1.4电流迹线;B:Nav1.4电流/Nav1.4最大电流在500nMxa0CnIIIA浓度下随时间的图表。电流已经归一化至1。维持电位是-90mV并且测试电位是-10mV;图15中,A:显示在作为对照的HEK细胞中记录的钠电流;B:在50nMCnIIIA存在下;以及C:由CnIIIA所致的钠电流抑制与时间的函数关系。注意在稳态水平后的洗涤步骤不足以抑制阻断作用。
具体实施方式
如本文中所用,“一种(a)”或“一种(an)”意指“至少一个”或“一个或多个”。如本文中所用,术语“肽”、“蛋白质”、“多肽”、“多肽的”和“肽的”可互换使用以表示通过相邻残基的α-氨基和羧基间的肽键而相互连接的一系列氨基酸残基。如本文中所用,术语“含有”通常用作包括的意思,也即允许存在一个或多个特征或成分。芋螺肽是可以与芋螺毒素及芋螺毒素肽互换的另一个术语。芋螺毒素是一些效力最强和最多样的已知神经毒素,具有难以置信的广泛的作用范围。有趣的是,不仅在食贝种类和食鱼种类之间存在明显区别,而且组内的种类之间甚至相同种类的个体之间也存在明显区别。来自食鱼芋螺的毒素对人类系统的生物活性也比食贝类芋螺强,而且已经出现死亡。三个主要类别的麻痹性毒素已经成为透彻研究的焦点,其中这三类麻痹性毒素均干扰神经元通信,但干扰不同的靶:α-芋螺毒素结合并抑制烟碱乙酰胆碱受体;μ-芋螺毒素通过与突触后钠通道结合而直接消除肌动作电位;和ω-芋螺毒素通过防止钙以电压激活方式进入神经末梢而减少乙酰胆碱的释放。μ-芋螺肽分离自芋螺属海生芋螺的毒液。μ-芋螺肽的一级结构由通过3个二硫桥(disulfidexa0bridge)折叠的15-30个氨基酸组成。这些肽靶向可以在肌肉或神经系统中存在的多种电压敏感性钠通道。已经鉴定了μ-芋螺肽类的多个成员并公布了它们的序列。来自地纹芋螺(C.geographus)毒液的GIIIA、GIIIB和GIIIC是骨骼肌VSSC而不是神经元VSSC的有效阻断剂(Cruz等,1985)。发现来自紫金芋螺(C.purpurescens)的PIIIA抑制肌肉的TTX-敏感性VSSC并且以较弱的程度抑制神经元TTX-敏感性VSSC(Shon等,1998)。不幸的是,这些芋螺毒素对神经元VSSC不是特别有效并且对骨骼肌VSSC没有选择性(GIIIA,GIIIB和GIIIC)、或不能够区分骨骼肌VSSC与神经元VSSC的亚型(PIIIA)。另外,已经证实这些肽缺少立体(3D)结构稳定性并且其构象易于在溶液中互变(Nielsen等,2002)。在鉴定和表征新的芋螺肽的过程中,申请人已经证实μ-芋螺肽家族显示出作为运动神经元以及感觉神经元中哺乳动物神经肌接头阻滞剂以及动作电位的有力抑制剂的极强烈的特征。这种新μ-芋螺毒素肽基本上包括如下SEQxa0IDxa0Noxa01所示的氨基酸序列、该氨基酸序列的生物活性片段、它们的盐、它们的组合和/或它们的变体:Xaa1-Xaa2-Cys-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-Cys-Cys-Xaa17SEQxa0IDxa0Noxa01其中Cys表示半胱氨酸。通常,Xaa1是任何N-修饰的酸性氨基酸。优选地,这种修饰选自包括乙酰化、甲酰化、肉豆蔻酰化(myristoylation)或吡咯烷酮的组中。甲酰化施用于甲硫氨酸(N-甲酰基甲硫氨酸)。乙酰化施用于许多残基,包括甲硫氨酸(N-乙酰基甲硫氨酸)、苏氨酸(N-乙酰基苏氨酸)、丝氨酸(N-乙酰基丝氨酸)、天冬氨酸(N-乙酰基天冬氨酸)、谷氨酸(N-乙酰基谷氨酸)、甘氨酸、缬氨酸和丙氨酸。肉豆蔻酰化施用于N-肉豆蔻酰基甘氨酸。最优选地,修饰的酸性氨基酸为焦谷氨酸盐(pyroglutamate)(pGlu或Z)。Xaa2优选为甘氨酸(Gly)。Xaa3为任何酸性氨基酸或酸性氨基酸的任何酰胺形式。优选地,Xaa3为天冬酰胺(Asn)。Xaa4通常为甘氨酸(Gly)。Xaa5通常为脯氨酸或羟基-脯氨酸。Xaa6为任何碱性氨基酸。优选地,Xaa6为赖氨酸(Lys)。Xaa7通常为甘氨酸(Gly)。Xaa8为任何非芳族羟基氨基酸。优选地,Xaa8为丝氨酸(Ser)。Xaa9为任何非芳族羟基氨基酸。优选地,Xaa8为丝氨酸(Ser)。Xaa10为任何碱性氨基酸。优选地,Xaa10为赖氨酸(Lys)。Xaa11为任何芳族氨基酸。优选地,Xaa11为色氨酸(Trp)。Xaa12为任何碱性氨基酸。优选地,Xaa12为精氨酸(Arg)。Xaa13为任何酸性氨基酸或酸性氨基酸的任何酰胺形式。优选地,Xaa13为天冬氨酸(Asp)。Xaa14为任何碱性氨基酸或任何含硫氨基酸。优选地,Xaa14为甲硫氨酸(Met)或组氨酸(His)。Xaa15为任何疏水性或非极性氨基酸,或任何非芳族羟基氨基酸。优选地,Xaa15为丙氨酸(Ala)。Xaa16为任何碱性氨基酸。优选地,Xaa16为精氨酸(Arg)。Xaa17为非极性氨基酸,或酰胺基。Xaa17也可以是缺失的。任选地,在如上所述的μ-芋螺毒素中,成对的Cys残基可以用等排性内酰胺(isotericxa0lactam)或酯-硫醚替换物如Ser/(Glu或Asp)、Lys/(Glu或Asp)、Cys/(Glu或Asp)或Cys/Ala组合成对地替换。通过已知方法(Barnay等,2000;Hruby等,1994;Bitan等,1997)进行依次偶联(sequentialxa0coupling),可以使天然Cys桥被替换为内酰胺桥。可以使用从RSP氨基酸类似物(RSPAmionAcidxa0Analogues)商购得到的卤代丙氨酸残基,容易地合成硫醚类似物。本发明还涉及μ-芋螺毒素,其中包括氨基酸Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6和Xaa7在内的至少一种氨基酸、或它们的任意组合是缺失的(组1)。还设想这样的μ-芋螺毒素,其中包括氨基酸Xaa8、Xaa9、Xaa10和Xaa11在内的至少一种氨基酸、或它们的任意组合是缺失的(组2)。还完成了本发明的μ-芋螺毒素肽,其中包括氨基酸Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15和Xaa16在内的至少一种氨基酸、或它们的任意组合是缺失的(组3)。备选地,在本发明的同一个μ-芋螺毒素肽中,三个来自组1、2或3的上述氨基酸、或它们的组合可以是缺失的。具有脂族R基团的示例性的疏水性氨基酸包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)。具有非芳族羟基的示例性氨基酸包括丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)。示例性的含硫氨基酸包括半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)。示例性的酸性氨基酸及其酰胺形式包括天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和焦谷氨酸(pGlu)。示例性的碱性氨基酸包括精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)。示例性的芳族氨基酸包括苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)。示例性的亚氨基酸例如包括脯氨酸(Pro)和羟脯氨酸(Hyp或Hpro或O)。本发明还考虑μ-芋螺毒素肽的“生物活性片段”,“生物活性片段”是指氨基酸长度比所述肽的序列少的序列。这种序列可以使用,只要它显示与从中衍生出该序列的天然序列基本上相同的特性或生物学活性即可。优选地,该序列含有的氨基酸长度小于本发明的肽的相应序列的99%、优选小于本发明的肽的相应序列的90%、特别地小于本发明的肽的相应序列的60%并且更特别地小于本发明的肽的相应序列的30%。还设想了本发明的μ-芋螺毒素肽的盐,如酸加成盐或金属络合物,例如与锌、铁等的金属络合物(为本申请的目的而被视为盐)。此类酸加成盐的示例是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸盐等。“药物前体”也包括在本发明中,所述药物前体是代表本发明的活性μ-芋螺毒素肽的非活性形式的实体。换句话说,本发明涉及稳定的可溶性的肽折叠前体(组合物),该肽折叠前体具有对细胞产生所需生理作用的潜力,但初始时是惰性的(即不产生所述作用),只有在经过一些修饰后才变得有生理活性并且对细胞产生所述的生理作用,即在生物转化后变得有药理活性。μ-芋螺毒素肽的生物转化可以在生理条件(体外和体内)下进行并且是与酶或体液如胃酸、血液等进行反应而经历酶促氧化、还原、水解等或化学水解的结果,以通过酰基转移反应转化成活性化合物。本发明还包括本发明μ-芋螺毒素肽的变体。术语“变体”是其氨基酸序列与肽的天然序列具有一定程度的差异的肽,也即因保守性氨基酸替换(conservativexa0aminoxa0acidxa0substitution)而不同于天然序列的氨基酸序列,因而一个或多个氨基酸被其它具有相同特征和构象作用的氨基酸所替换。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的特定位置上具有替换、缺失、侧链修饰、和/或插入。保守性氨基酸替换在本文中定义为在以下5组氨基酸中的一个组的范围内交换:I.小的脂族、非极性或轻微极性的残基:Ala、Ser、Thr、Pro、GlyII.极性、带正电荷的残基:His、Arg、LysIII.极性、带负电荷的残基和它们的酰胺:Asp、Asn、Glu、GlnIV.大的芳族残基:Phe、Tyr、TrpV.大的脂族非极性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys。应当理解一些非常规氨基酸也可以用来替换天然存在的氨基酸。例如Lys残基可以被鸟氨酸、高精氨酸、正赖氨酸(nor-Lys)、N-甲基-赖氨酸、N,N-二甲基-赖氨酸和N,N,N-三甲基-赖氨酸所替换。Lys残基也可以被合成的碱性氨基酸所替换,所述合成的碱性氨基酸包括但不限于N-1-(2-吡唑啉基)-精氨酸、2-(4-胡椒基(piperinyl))-甘氨酸、2-(4-胡椒基)-丙氨酸、2-[3-(2S)吡咯烷基(pyrrolininyl)]-甘氨酸和2-[3-(2S)吡咯烷基]-丙氨酸。Tyr残基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、间-Tyr、邻-Tyr、正-Tyr、125xa01-Tyr、单卤代-Tyr、二卤代-Tyr、O-磺基-Tyr、O-磷酸(phospho)-Tyr和硝基-Tyr所替换。Tyr残基也可以被3-羟基或2-羟基异构体(分别是间-Tyr或邻-Tyr)和相应的O-磺基-和O-二氧磷基衍生物所替换。Tyr残基也可以被含有羟基的合成氨基酸(包括但不限于4-羟甲基-Phe、4-羟苯基-Gly、2,6-二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr)所替换。脂族氨基酸可以被具有非天然的脂族支链或直链侧链C_nH_2n+2的合成的衍生物所替换,其中n为1-8的数字。在WO2004/0099238中给出了用非常规氨基酸进行的合适的保守性替换的实例(见表1)。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="685"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="456"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="476"/>插入包括添加一个或多个天然存在的氨基酸残基或非常规氨基酸残基,不过优选地不是半胱氨酸残基。缺失包括缺失一个或多个氨基酸残基,不过优选地不是半胱氨酸残基。如上所述,本发明包括其中除Cys之外的一个或多个氨基酸已经发生侧链修饰的肽。由本发明构思的侧链修饰的实例包括氨基的修饰,如与醛反应随后用NaBH₄进行还原的还原性烷基化;用亚氨逐乙酸甲酯(methylacetimidate)进行的酰胺化(amidination);用乙酸酐进行的酰化作用;用氰酸盐进行的氨基的氨甲酰化;用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)进行的氨基的三硝基苄化(trinitrobenzylation);用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐进行的氨基的酰化作用;和用5-磷酸吡哆醛并随后用NaBH₄还原而进行的赖氨酸的吡哆化(pyridoxylation);和N-乙酰化。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物而被修饰。羧基可以通过形成O-酰基异脲(acylisourea)而进行碳二亚胺活化并随后衍生成为相应的酰胺而被修饰。酸性氨基酸可以被甘氨酸和丙氨酸的四唑基衍生物所替换,如WO02/060923(COGNETIXxa0INC;Univ.Utahxa0Resxa0Found.)中所述。酪氨酸残基可以例如通过4-位上的甲氧化而改变。酪氨酸也可以通过用四硝基甲烷进行硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变。组氨酸残基的咪唑环修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙氧羰化而实现。脯氨酸残基可以通过例如4-位上的羟化而被修饰。由本发明构思的其它变体包括一系列糖基化变体。改变的糖基化模式可以因重组分子在不同宿主细胞中的表达而产生。Ser、Thr和Hyp残基可以被修饰以含有O-聚糖,而Asn和Gln残基可以被修饰以形成N-聚糖。根据本发明,术语′′聚糖(glycan)′′是指N-、S-或O-连接的单糖、二糖、三糖、多糖或寡糖,其可以通过本领域已知的合成方法或酶方法而连接到天然氨基酸或修饰氨基酸的任何羟基、氨基或巯基。构成聚糖的单糖可以包括D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾杜糖、D-半乳糖、D-塔洛糖、D-半乳糖胺、D-葡糖胺、D-N-乙酰基-葡萄糖胺(GIcNAc)、D-N-乙酰基-半乳糖胺(GalNac)、D-岩藻糖或D-阿拉伯糖。可以对这些糖作结构性修饰,即用一个或多个O-硫酸盐、O-磷酸盐、O-乙酰基或酸性基团如唾液酸,包括它们的组合。聚糖还可以包括相似的多羟基团,如D-青霉胺2,5和其卤化衍生物、或聚丙二醇衍生物。糖苷键是β和1-4或1-3,优选是1-3。聚糖与氨基酸之间的连接键可以是α或β,优选α并且是1-。另外,因为天然肽(处于L-形式)的内在问题是被天然蛋白酶降解,因此可以制备本发明的肽以包括肽的D-形式和/或′′逆反式异构体(retro-inversoisomer)′′。优选地,制备本发明肽的短部分、变体或其组合的逆反式异构体。保护所述肽免受天然蛋白水解,因此应当增加特定异二价(heterobivalent)或异多价化合物的效力。与含有非逆反式的类似物比较时,预计含有逆反式的肽具有更高的生物学活性,原因是得到保护而免受天然蛋白酶的降解。此外,已经证实它们显示出增强的稳定性和较低的免疫原性[Selaxa0M.和Zismanxa0E.,(1997)Differentxa0rolesxa0ofxa0D-aminoxa0acidsxa0inxa0immunephenomena-FASEBxa0J.11,449]例如,如在Sela和Zisman,(1997)中所述,对序列已知的肽制备逆反式肽。′′逆反式异构体′′是指直链肽的异构体,其中序列的方向逆转并且每个氨基酸残基的手性倒置;因此,可能不存在端基互补性。本发明还包括其中一个或多个肽键已经由其它类型的不易受肽酶裂解的共价键(肽模拟物)替换的类似物。尽管注射至受试者后,肽的蛋白水解性降解是个问题,然而用不可裂解的肽模拟物替换特别敏感的肽键将使生成的肽更稳定,并且因此作为活性物质更为有用。此类模拟物和将这些模拟物引入肽的方法是本领域公知的。还可以使用氨基端封闭基团如叔丁氧羰基、乙酰基、二甲基甲硅烷基(theyl)、琥珀酰基、甲氧基琥珀酰基、环庚基、已二酰基、壬二酰基(azelayl)、丹酰基、苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基、甲氧基壬二酰基(methoxyazelayl)、甲氧基己二酰基、甲氧基环庚基和2,4-二硝基苯基。构思并可以完成本发明的μ-芋螺毒素的组合或其特别的生物活性片段的组合以改进本发明现存的肽的效力、选择性或稳定性。优选地,μ-芋螺毒素肽选自包括SEQxa0IDxa0Noxa02和SEQxa0IDxa0Noxa03的组中:pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-His-Ala-Arg-Cys-CysSEQxa0IDxa0Noxa02pGlu-Gly-Cys-Cys-Asn-Gly-Pro-Lys-Gly-Cys-Ser-Ser-Lys-Trp-Cys-Arg-Asp-Met-Ala-Arg-Cys-CysSEQxa0IDxa0Noxa03。通常,这些肽的羧基末端被酰胺化。应当理解的是,术语μ-芋螺毒素肽或μ-芋螺毒素不限于从芋螺属中得到的天然存在的毒性肽,而仅仅是表示所述肽的初始来源或从中衍生出所述肽的初始来源。本发明的μ-芋螺毒素肽以及其片段、组合和变体可以通过本领域已知的多种方法和技术进行制备,例如在Maniatis等1982,Molecularcloning,Axa0laboratoryxa0Manual,Coldxa0Springxa0Harborxa0Laboratory和Amblard等2005中所述的化学合成技术或重组技术。当使用重组技术来制备本发明的μ-芋螺毒素肽时,优选使用编码所述多肽的核酸分子或其生物活性片段。因此,本发明还涉及分离或纯化的核酸序列,该核酸序列包括编码如上所述的氨基酸序列的核苷酸序列。“分离或纯化的核酸序列”是指其中编码本发明的μ-芋螺毒素肽的核酸分子或编码所述μ-芋螺毒素肽的核酸将是符合本发明的状态。核酸将不含或基本上不含与该核酸天然结合的物质,如在该核酸的天然环境中发现的其它多肽或核酸,或在通过在体外或体内实施的重组核酸技术制备所述核酸的环境中(例如细胞培养)发现的其它多肽或核酸。术语“核酸”是指DNA或RNA。在核酸是DNA的情况下,则在本文中可以使用的DNA是任何聚脱氧核苷酸序列,包括例如双链DNA、单链DNA、其中一条或两条链均由两个或多个片段构成的双链DNA、其中一条或两条链具有不间断的磷酸二酯主链的双链DNA、含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA、其中DNA链充分互补的双链DNA、其中DNA链仅部分互补的双链DNA、环状DNA、共价性闭合的DNA、线性DNA、共价交联的DNA、cDNA、化学合成的DNA、半合成的DNA、生物合成的DNA、天然分离的DNA、酶消化的DNA、剪切的DNA、标记DNA如放射标记的DNA和荧光标记的DNA、含有一种或多种非天然存在种类的核酸的DNA。编码μ-芋螺毒素肽的DNA序列或其生物活性片段可以通过标准化学技术例如磷酸三酯法合成、或通过自动化合成法和PCR法合成。编码本发明μ-芋螺毒素肽的纯化和分离的DNA序列也可以通过酶技术制得。因此,可以使用在预定识别序列上切割核酸分子的限制酶以从含有核酸序列(如编码μ-芋螺毒素肽或其片段的DNA(或RNA))的更大核酸分子中分离出该核酸序列。本发明还包含处于聚核糖核苷酸形式(RNA)的核酸,所述聚核糖核苷酸包括例如单链RNA、双链RNA、单链RNA、其中一条或两条链均由两个或多个片段构成的双链RNA、其中一条或两条链具有不间断的磷酸二酯主链的双链RNA、含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA、其中RNA链充分互补的双链RNA、其中RNA链仅部分互补的双链RNA、共价交联的RNA、酶消化的RNA、剪切的RNA、mRNA、化学合成的RNA、半合成的RNA、生物合成的RNA、天然分离的RNA、标记RNA如放射标记的RNA和荧光标记的RNA、含有一种或多种非天然存在种类的核酸的RNA。分离或纯化的核酸序列、DNA或RNA也包括与编码本发明μ-芋螺毒素肽的核酸序列具有实质序列同一性或同源性的分离或纯化的核酸序列。优选地,核酸将具有实质序列同一性,例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的核酸同一性;更优选90%的核酸同一性,并且最优选的是至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。如本领域已知并在本文中所用,同一性是通过比较所述序列而确定的两种或多种氨基酸序列或两种或多种核酸序列之间的关系。根据具体情况,同一性还指通过所述序列串之间的匹配而确定的氨基酸或核酸序列之间的序列相关性的程度。同一性和相似性是技术人员公知的术语并且它们可以通过常规方法计算(例如见Computationalxa0Molecularxa0Biology,Lesk,A.M.ed.,Oxfordxa0Universityxa0Press,Newxa0York,1988;Biocomputing:Informaticsxa0andGenomexa0Projects,Smith,D.W.ed.,Academicxa0Press,Newxa0York,1993;ComputerAnalysisxa0ofxa0Sequencexa0Data,Partxa0I,Griffin,A.M.andxa0Griffin,H.G.ed.,HumanaPress,Newxa0Jersey,1994;Sequencexa0Analysisxa0inxa0Molecularxa0Biology,vonxa0Heinje,G.Academicxa0Press,1987和Sequencexa0Analysisxa0Primer,Gribskov,M.andxa0Devereux,J.ed.M.Stocktonxa0Press,Newxa0York,1991,Carillo,H.andxa0Lipman,D.,SIAMxa0J.Appliedxa0Math.48:1073,1988)。通常优选设计旨在产生序列间最大匹配的方法。在公众可获得的计算机程序中编撰了用于确定同一性和相似性的方法,包括GCG程序包(DevereuxJ.等,Nucleicxa0Acidxa0Researchxa012(1):387,1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul,S.F.等J.Molec.Biol.215:403-410,1990)。BLASTxa0X程序可公开地从NCBI和其它来源(BLASTxa0Manual,Altschul,S.等NCBIxa0NLMxa0NIHBethesda,Md.20894;Altschul,S.等J.Mol.Biol.215:403-410,1990)得到。本发明还包含与编码本发明μ-芋螺毒素肽的分离或纯化的核酸序列互补的核酸序列。简并性(degenerated)核酸序列也在本发明范围内,由于遗传密码子的简并性,所述简并性核酸序列的核酸序列与编码本发明μ-芋螺毒素肽的核酸序列或其互补序列不同。这种核酸编码具有等同功能的μ-芋螺毒素肽,但是在序列上因遗传密码子简并性而与所述肽的序列不同。这可以产生不影响氨基酸序列的沉默突变。任何及全部的此类核酸变化都在本发明的范围内。此外,还考虑了能够在严格条件、优选高严格条件下与编码本发明μ-芋螺毒素肽的核酸序列、其互补的核酸序列或其简并性核酸序列杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适严格性条件是本领域技术人员已知的,或可以在Currentxa0Protocolsxa0inxa0Molecularxa0Biology,Johnxa0Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。例如可以使用约45°C的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC),随后用50°C的2.0Xxa0SSC进行洗涤。严格性可以基于洗涤步骤中使用的条件进行选择。例如,洗涤步骤中的盐浓度可以选自约0.2Xxa0SSC在50°C下的高严格性。此外,洗涤步骤中的温度可以在高严格条件下为约65°C。本发明还包括编码本发明μ-芋螺毒素肽的分离或纯化的核酸,其包括编码μ-芋螺毒素肽的截短物(truncation)或类似物的核酸序列。术语“截短物”指这样的序列,其编码的肽所含有的氨基酸比天然序列少,但显示相同的特征。本发明也包括所公开的分离和纯化的核酸序列的等位基因变体;也即所述分离或纯化的核酸的天然存在的可选择的形式,其也编码与由分离和纯化的核酸序列所编码的肽相同、同源或相关的肽。可选择地,非天然存在的变体可以通过诱变技术而产生或通过直接合成而产生。也考虑了公开的分离和纯化的核酸序列的生物活性片段并且是指这样的序列,其含有的核苷酸长度比编码μ-芋螺毒素肽的核酸序列、其互补的核酸序列或其简并性核酸序列少。可以使用这种序列,只要该序列显示如从中衍生出该序列的天然序列那样相同的特性即可。优选地,该序列的氨基酸长度小于μ-芋螺毒素肽的相应分离和纯化的核酸序列的氨基酸长度的90%、优选小于60%、特别优选小于30%。本发明还涉及提供一种表达载体,该表达载体包括编码μ-芋螺毒素肽的分离或纯化的核酸序列。如本领域公知,表达载体的选择直接取决于所需的功能特征,例如μ-芋螺毒素肽表达、和待转化或转染的宿主细胞。邻人惊讶地,申请人已经证实如本文中所述的μ-芋螺毒素肽显示出用于麻醉药应用的有用且有效的生物学活性。这些肽清楚地显示出的活性比目前所用的局部麻醉药如普鲁卡因或利多卡因更好,并且活性持续时间长很多。这些μ-芋螺毒素可以因此用于其中需要长时间和高效麻醉的特定病例。它们也可以作为备选物使用以防止与常见麻醉药如普鲁卡因或利多卡因相对应的不想要的副反应或过敏(Finucanexa0B.T.,2005)。通过与科学文献中、以上提及的专利和所附实施例中可获得的数据相比较,这些μ-芋螺毒素还在生物学活性方面显示出更好的效力。因此,本发明也涉及一种药物组合物,该药物组合物含有药物有效量的所述的至少一种μ-芋螺毒素肽作为活性物质,选择性地,该活性物质与制药学上可接受的载体、稀释剂、和/或辅药组合。“药物有效量”指在施用至人或动物有机体时诱导可检测的药理学或生理学作用的化学材料或化合物。相应的药物有效量可能取决于待治疗的具体患者、待治疗的疾病和给药方法。此外,药物有效量取决于所用的具体肽,尤其当肽额外地含有或不含有如所述的药物时。治疗通常包括药物组合物的多次给药,通常间隔几小时、几日或几周。药物有效量的多肽剂量单位通常是待治疗患者每千克体重0.001ng-100μg。优选地,每千克体重0.1ng-10μg。优选地,除了如本文中所述的至少一种μ-芋螺毒素肽之外,药物组合物还可以含有一种或多种制药学上可接受的载体、稀释剂和辅药。在所用的剂量和浓度上,有助于将活性化合物加工成可以药用的制剂中的可接受的载体、稀释剂和辅药对赋形剂是无毒的,并且包括:缓冲剂,如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵;氯化六甲铵;苯扎氯铵、苄索氯铵;苯酚、丁醇或苄醇;尼泊金烷基酯如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯;儿茶酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇和间甲酚);低分子量(少于约10个残基的)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物,如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它糖,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,如乙二胺四乙酸(EDTA);糖,如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐反离子如钠;金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物);和/或非离子表面活性剂如TWEENntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="46"/>、PLURONICSntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="42"/>或聚乙二醇(PEG)。药物组合物的给药形式可以是系统给药或局部给药。例如,这种组合物的给药可以是多种胃肠道外途径,如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经皮肤、口腔途径或通过植入装置,并且也可以通过蠕动方法送递。本发明还构思了一种植入装置,该植入装置包括本发明的μ-芋螺毒素或药物组合物。含有如本文中所述的μ-芋螺毒素肽作为活性药物的药物组合物以及麻醉药也可以加入或渗透至生物可吸收的基质内,该基质以基质混悬剂、凝胶或固体支持物的形式给药。此外,基质可以含有生物聚合物。可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有μ-芋螺毒素肽的固体疏水性聚合物的半渗透性基质,其中所述基质的形式为成形物品,例如膜、微球、植入物或微胶囊。缓释基质的实例包括聚苯乙烯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸与[γ]乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONxa0DEPOT(TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德构成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟丁酸。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这容易地通过经无菌滤膜过滤而实现。可理解的是,本发明μ-芋螺毒素肽的合适剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康情况和体重、同时治疗的类型(如果有的话)以及所需作用的性质。合适的剂型将取决于疾病、肽和给药模式;可能的剂型包括片剂、胶囊、锭剂、牙科糊剂、栓剂、吸入剂、溶液剂、软膏剂、乳膏剂和胃肠道外长效药剂(parenteralxa0depot)。在吸入剂的情况下,剂型优选地是喷雾剂形式。制得本发明μ-芋螺毒素的鼻制剂以提供例如高效的上皮细胞钠通道抑制。通过鼻喷雾剂所注射的量取决于受试者特征,如年龄和体重。确定有效剂量范围是本领域技术人员的例行工作。作为具体制剂的实例,体积为约30-300μL的每日鼻喷雾制剂中的μ-芋螺毒素量可以送递约1-10μg的μ-芋螺毒素每日剂量。需要理解的是,每日喷雾体积可以在一个、两个或多个送递中施用以实现所需要的每日总喷雾体积。还需要理解的是,可以分别地独立调节鼻制剂中的喷雾剂体积和μ-芋螺毒素的量以实现所需的每日剂量。因为对μ-芋螺毒素肽中的氨基酸的氨基酸修饰也被本发明所包括,因此,这可以用于将本发明μ-芋螺毒素肽交联至不溶于水的基质或其它大分子载体,或用于改善溶解度、吸收性和穿过血脑屏障的通透性。此类修饰是本领域公知的,并且可以选择性地消除或减弱肽等的任何可能的不想要的副作用。尽管本发明的优选的药物组合物含有μ-芋螺毒素肽作为活性药物,然而备选的药物组合物可以含有如本文中所述的编码μ-芋螺毒素肽的分离或纯化的核酸序列作为活性药物。这种药物组合物可以包括单独的分离和纯化的DNA序列,包含所述分离和纯化的DNA序列的表达载体,和先前转染或转化有在此所述的表达载体的宿主细胞。在后面的实施例中,宿主细胞优选地自待治疗的患者中分离出来以避免任何抗原性问题。这些基因和细胞治疗法极适用于需要反复施用药物组合物的患者,因为所述的纯化和分离的DNA序列、表达载体或先前转染或转化有表达载体的宿主细胞可以并入患者的细胞,这种细胞随后内源性地产生蛋白质。通常,如本文中所述的药物组合物用于治疗或预防疼痛。待治疗或预防的疼痛将选自例如偏头痛、急性疼痛、持续性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛或伤害性疼痛(nociceptivexa0pain)。备选地,如本文中所述的药物组合物用于治疗囊性纤维化或耳鼻喉病(oto-rhino-laryngologicalxa0disease)。由于本发明的μ-芋螺毒素是钠通道抑制剂,因此它可以施加至呼吸道上皮和鼻膜以阻断由上皮细胞钠通道所致的钠摄取增强。这具有降低粘膜粘度的作用并促进更好地清除外部生物流体如肺液体和鼻液体。在此方面,低浓度的μ-芋螺毒素抑制与囊性纤维化病和炎症相关的存在于粘膜上的钠通道,其中产生的粘液高于正常水平。上皮细胞钠通道调节粘性肺液体和鼻液体的清除。施加不同浓度的药物组合物将诱导更好地清除粘膜中生物性流体的聚集,所述药物组合物含有毫摩尔和亚毫摩尔范围的本发明的μ-芋螺毒素。因此在治疗粘膜内存在异常流体分泌的耳鼻喉炎症中,μ-芋螺毒素具有治疗效力。μ-芋螺毒素应用还专用于有效治疗在囊性纤维化中出现的异常肺分泌物。本发明还包括本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防与电压敏感性钠通道相关的病症的药物中的用途。本发明μ-芋螺毒素肽通常将以实现预期目的的量使用。为用于治疗或预防疼痛,肽或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。“治疗有效量”是有效改善或预防症状的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内,尤其是按照本文提供的详细内容。对于系统给药(systemicxa0administration),治疗有效量或剂量可以从体外分析法中初步地估计。例如,剂量可以在动物模型中制订以实现包括如在细胞培养中所确定的IC₅₀在内的循环浓度范围。此类信息可以用来更精确地确定在人体中的有用剂量。也可以使用本领域公知的技术,从体内数据例如动物模型中估计初始剂量。基于动物数据,并且当然将基于正在治疗的受试者的体重、病症严重性、给药方式和处方医生的判断力,本领域技术人员可以容易地使对人的给药最优化。本发明还包括本发明的药物组合物在制备麻醉药中的用途。本申请公开的内容还提供用于在接受需要麻醉的手术操作的患者中提供骨骼肌松弛的方法,该方法包括将本发明至少一种μ-芋螺毒素肽或其制药学上可接受的盐以药物有效量给药至需要的患者。如在本发明中使用,“给药的(administered)”或“给药(administering)”意指“给予”或“使接触”并且是指药物组合物、治疗组合物或麻醉组合物与受试者接触,所述受试者优选为人。通常,在以上所述的方法中,至少一种μ-芋螺毒素肽作为局部麻醉药进行给药。优选地,至少一种μ-芋螺毒素肽用于例如眼科学、肌张力失常治疗、耳鼻喉科学、肛裂治疗、皮肤病学、创伤学、整容手术、纤维肌痛和慢性肌筋膜疼痛的治疗以及所有疼痛的治疗中。优选地,至少一种μ-芋螺毒素肽作为眼科麻醉药进行给药。本发明还包括一种用于局部麻醉的方法,该方法包括以药物有效量给药本发明的至少一种μ-芋螺毒素肽或其制药学上可接受的盐。优选地,本发明的至少一种μ-芋螺毒素肽或药物组合物的所述药物有效量提供如实施例中公开的长效且持久的作用。优选地,长的作用持续时间是约30分钟至48小时,取决于待治疗的受试者和/或本发明所用的μ-芋螺毒素的浓度。然而,在任何情况下,所述的持续时间比迄今对常用麻醉药如利多卡因或普鲁卡因所述的任何持续时间都长。优选地,持续时间是30分钟至12小时。本发明还包括一种麻醉药,该麻醉药含有在申请中所述的药物组合物或μ-芋螺毒素肽。优选地,所述麻醉药适用于皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经皮肤、口腔途径或植入装置。通常,麻醉药的形式是片剂、胶囊、锭剂、牙科糊剂、栓剂、吸入剂、溶液剂、软膏剂、乳膏剂和胃肠道外长效药剂。优选地,所述吸入剂是喷雾剂。实施例实施例1:材料和方法材料在切斯特菲尔德岛(chesterfieldxa0Island)(Newxa0Caledonia)收集耸肩芋螺(Conusxa0consors)的标本并立即在-80°C冷冻。从新鲜剖取的毒液导管器中得到毒液,并用0.08%的三氟乙酸(TFA)水溶液提取。把从几个毒液导管中得到的提取物离心以除去不溶性颗粒。将来自所有提取的上清液合并、冻干、称重并贮藏在-80°C直至需要使用时。色谱法使用配备有TSP-150UV检测仪的热分离产物(Thermoxa0SeparationProduct,TSP)高压液相色谱系统对粗制冻干毒液进行分馏。以下是用于反相色谱的洗脱缓冲液:缓冲液A,H₂O/0.1%TFA;缓冲液B,H₂O/CH₃CNxa040/600.1%TFA。使用如下梯度的C18Vydacxa0218TP510柱实施粗制毒液的半制备性运行。程序是0-8%B/5分钟,8-80%B/70分钟,80-100%B/10分钟,随后是100%B/10分钟(流速,2ml/分钟)。使用分析用C18xa0Vydacxa0218TP54柱的深度纯化步骤以如下梯度实施,如0-10%B/5分钟,10-20%B/10分钟,20-40%B/40分钟。在220nm上检测分馏物。氨基酸组成和埃德曼(Edman)测序通过在管形瓶的底部添加200ml6Mxa0HCl以对肽样品进行水解,其中所述管形瓶被抽真空、密封并在120°C下加热16小时。水解产物在配备有在线衍化器(型号420A)的自动分析仪(Appliedxa0Biosystems,型号130A)上进行分析,其中所述在线衍化器将游离氨基酸转化成它们的苯基硫代氨甲酰基衍生物。通过Edman降解法在自动的Appliedxa0Biosystemsxa0477A微量测序仪上进行测序试验。在测序前,同质的肽用二硫苏糖醇在6M盐酸胍,0.5MTris/HCl,2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(pHxa07.5)中还原1小时并随后用4-乙烯基吡啶(1.5μM)在室温处理3小时。肽衍生物通过使用C₁₈xa0Vydac柱(4.6mm×25cm,粒度为5μm)的反相高效液相色谱(HPLC)进行纯化。质谱法在配备有电喷雾离子源的QTOFxa0I仪(Micromass/Waters,USA)上进行分子量测量。样品分析在阳性模式上使用载体输入溶剂H₂O/CH₃CN/HCOOH(49.9/49.9/0.2)而实施。具有TOF-MS配置的单MS实验用于简单的分子量测定。实施串联质谱法以进行结构性研究。在这种配置中,母质量(parentxa0mass)首先使用四极杆(quadrupole)加以选择,并且通过手工调节碰撞能而实施由碰撞所诱导的解离作用。在这种情况下,天然样品事先使用在碳酸氢铵缓冲液(pHxa07.8)中的100mM二硫苏糖醇(DTT)于56°C还原3小时。还原的肽随后使用ZipTip(Millipore,USA)根据制造商的方案进行脱盐。借助软件MassLynx(Micromass/Waters,USA),使用MaxEnt3选项将所得的多电荷谱(multiply-chargedxa0spectra)转化成单电荷数据。随后运行手工和半自动数据处理以进行序列表征。肽合成使用用于逐步Boc化学链延伸的原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)活化方案,在来自AppliedBiosystems的定制改良型433A肽合成仪上实施固相合成。在链装配完成后,使肽脱保护并在0°C通过用无水HF处理1小时,用5%对甲酚作为清除剂而从树脂上切下。在切割后,肽用冰冷二乙醚沉淀,溶解在含水的乙腈中并进行冻干。使用在缓冲液A(H₂O/0.1%三氟乙酸)中的缓冲液B(乙腈/10%H₂O/0.1%三氟乙酸)的线性梯度,用Vydacxa0C18柱通过RP-HPLC对肽进行纯化,并在214nm进行紫外线检测。样品通过电喷雾质谱法以Platformxa0II仪器(Micromass,Manchester,England)进行分析。为使肽氧化折叠,将材料(约0.5-1mg/mL)溶解在含有0.5mM还原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽的0.5Mxa0GuHCl,100mMxa0Tris(pHxa07.8)中。在室温下温和搅拌过夜后,通过如上所述的RP-HPLC对蛋白质溶液进行纯化。折叠步骤的整体产率大约是35%。蛙和小鼠神经肌肉制备物从重20-25g的双髓斑(doublexa0pithed)雄蛙(食用蛙(Ranaxa0esculenta))中取出皮胸肌和伴随神经并钉在2ml组织浴槽的基部,该浴槽中灌注有含有(单位mM):NaCl,115.0;KCl,2.0;CaCl₂,1.8和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液,5.0(pHxa07.25)的标准溶液。在一些实验中,刺激-收缩通过用2M甲酰胺处理皮胸肌神经肌肉制备物(cutaneousxa0pectorisxa0neuromuscularpreparations)而解偶联。从通过颈椎脱位处死并随后立即放血的瑞士韦伯斯特(Swiss-Webster)小鼠(20-25g)中分离左偏侧膈肌和右偏侧膈肌及伴随的膈神经。将这两个偏侧膈分开并且把每个偏侧膈架在Rhodorsil(ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="152"/>-Poulenc,St.Fons,France)衬里的器官浴槽(2ml容积)中,其中所述的器官浴槽中灌注有组成如下(单位mM)的生理溶液(哺乳动物克雷布斯-林格氏液(Krebs-Ringer’sxa0solution)):NaCl,154.0;KCl,5.0;CaCl₂,2;MgCl₂,1.0;HEPES缓冲液,5.0;葡萄糖,11.0。供有纯O₂的溶液的pH为7.4。小鼠坐骨神经制备物从通过颈椎脱位处死的小鼠中剖取出两侧坐骨神经(左侧和右侧)。在使用前,该神经用充氧的哺乳动物克雷布斯-林格氏液在室温淋洗30分钟。狗鱼嗅神经制备物左侧和右侧嗅神经取自断头的狗鱼(白斑狗鱼)。在使用前,每条神经用充氧的狗鱼林格氏液(Ringer’sxa0solution)(82.5mMxa0NaCl,2.5mMxa0KCl,1mMCaCl₂,1mMxa0Na₂HPO₄缓冲液,5mMxa0HEPES,1mMxa0MgCl₂,用NaOH调节至pHxa07.3)在室温下淋洗30分钟。小鼠神经肌肉制备物上的机械记录在这种类型的实验中,将小鼠偏侧膈肌的一端钉至组织浴槽并且另一端(腱)与等长收缩的(isometricxa0transucer)传感器(FT03,Grassxa0Instruments)连接。使用吸引电极(suctionxa0electrode),以频率0.1Hz的持续时间0.15毫秒的电流脉冲对运动神经进行刺激而诱发收缩。调节每种制备物的静息张力(restingtension)以至在正常条件下通过直接刺激肌肉或经运动神经间接刺激肌肉而得到最大的收缩反应。从传感器中记录的张力信号借助配备有数字界面的计算机(DT-2821,Dataxa0Translation)进行放大、收集和数字化。实验在室温下进行。蛙和小鼠神经肌肉制备物上的电生理学记录分离的神经肌肉制备物中的运动神经以0.05-0.1毫秒持续时间和超大电压(一般是3-8V)的脉冲经适合该神经直径的吸引微电极(suctionmicroelectrode)加以刺激。这些脉冲通过与刺激分离单元连接的S-44刺激仪(Grassxa0Instruments,Westxa0Warwick,U.S.A.)产生。使用常用技术和Axoclamp-2A系统(Axonxa0Instruments,Fosterxa0city,CA,U.S.A.),以填充有3Mxa0KCl的细胞内微电极(8-12MΩ电阻)在室温(22-24°C)下从终板区中记录膜电位和突触电位。记录在施加所测试的芋螺毒素之前和在所述施加全程期间从相同终板中连续地进行。借助于改良数字式录音处理器(Sonyxa0PCMxa0701xa0ES)和盒式磁带录像器(Sonyxa0SLC9F),电信号在放大后显示在数字式示波器上并且同时记录在录像带上。借助于配备有模拟及数字I/O接口板的计算机(DT2821,Dataxa0Translationxa0Marlboro,U.S.A.),数据以25kHz的采样速率进行收集和数字化。计算机化的数据的获取和分析是通过JohnDempster博士(Strathclyde大学,Scotland)提供的程序而实施的。终板电位(EPP)和微型终板电位(MEPP)分别就幅度和时程进行分析。对于研究的每种条件,进行3-6个独立实验并且将结果平均化以给出所提供的均值±均值的标准差(S.E.M.)。统计检验通过使用t检验(student’sxa0test)进行,认为P<0.05表示显著性。小鼠和狗鱼神经上的电生理学记录将来自小鼠的坐骨神经或狗鱼嗅神经设置在与树脂玻璃(Plexiglas)室连接的两对铂线(内直径0.5mm)上。为了刺激,第一对电极与送递多种幅度和时间的矩形电流脉冲的刺激仪(S-88,Grassxa0Instruments)相连接。为了记录整体动作电位(GAP),第二对电极与高倍率的自制微分放大器连接。一条额外的铂线将这两对电极接地。与电刺激相对应,神经活动在配备有模拟和数字转换器的计算机上借助软件程序Axonxa0Pclampxa06.0版(Axonxa0instruments)进行收集、数字化和记录。全部实验在室温进行。在记录期间,将神经保持在潮湿室内,而不与任何溶液发生任何紧密接触以避免任何短路。在每次记录之间,将神经安置在4°C下盛有林格氏液或试验溶液的小容器内。在兔眼上的体内实验在兔角膜上体内测定CnIII对表面神经末梢末端的局部麻醉活性。为此,使用体重1.5-2kg的长着有色眼的成年雄性智利(Chilean)兔。试验溶液缓慢灌注至一只眼的结膜囊内并在其中滞留2分钟。刺激通过来自尼龙毛刺激仪的压力以约2Hz的频率施加至角膜上直至诱发眼-眼睑反射(oculo-palpebralxa0reflex)。每个刺激期由100次刺激构成,或如果诱发了眼-眼睑反射,则由更少的刺激构成。两个刺激期间隔至少5分钟的间隔期。麻醉作用的强度表述为从施用试验溶液或麻醉溶液直至重新出现眼-眼睑反射的期间可以施加至角膜的刺激总数。该方法还允许测定麻醉作用的持续时间。使用利多卡因HCl(Sigma-Aldrich)的盐水溶液并且它的pH值用1NNaOH调节为6.9±0.01。实施例2:结果新μ-芋螺肽的分离、纯化和表征干燥的毒液溶解在0.08%的三氟乙酸(TFA)水溶液中并以10mg批量装载在半制备性C18多孔层实心球(Vydac)柱上。在色谱内大约20分钟洗脱的馏分(fraction)在分析级上进一步纯化。该馏分对蛙的神经肌接头显示出有效的初步活性。将这种馏分施用于所述离体制备物诱导了对由刺激运动神经所激发的肌肉收缩的阻断。所述馏分最终被纯化至如由紫外光(UV)色谱和电喷雾质谱(ESI-MS)质谱所证实的均一性(图1)。该馏分随后进行数次阿德曼(Edman)降解,但没有产生任何结果。对该馏分的氨基酸分析导致鉴定出几种不同的氨基酸(结果未显示),因而表明该馏分是肽质的,但带有可能封闭的氨基末端。为进一步表征该化合物,馏分使用DTT还原并且样品在分析前进行脱盐。随后在脱盐样品上实施串联质谱分析。选择在m/z596上的4x带电种类并且手工调节碰撞能,以提供适当和均一的肽片段。数据的人工注释导致赋予具有22个氨基酸的肽序列。该序列与先前发表的μ-芋螺肽共有同源性并因此得名CnIIIA(表4)。CnIIIA的化学合成肽如上所述进行装配(见肽合成)。合成的肽使用在酸化水中的乙腈(ACN)梯度,通过反相HPLC纯化至均一。肽纯度和完整性由ESI-MS控制。探索几种条件用于线性肽的氧化性再折叠。肽溶解在含有盐酸胍(0.5M)的pHxa07.8的Tris缓冲液(100mM),并且在4°C的空气氧化下静置或在含有多种比例的还原型/氧化型谷胱苷肽(gluthation)的混合物中静置。最终的再折叠实验使用Trisxa0100mM,盐酸胍0.5M和还原型/氧化型谷胱苷肽0.5mM/0.1mM进行。这种混合物在室温下搅拌过夜。该混合物随后使用乙酸酸化,并使用C18xa0SepPak筒(cartridge)按照制造商的方案进行浓缩。最终的折叠肽通过反相色谱以半制备级别进行纯化。其显示出均一性并且从线性实体(linearxa0entity)开始产率大约为35%。合成的化合物的纯度由HPLC和ESI-MS分析评估。具有天然形式的合成性肽的真实性(authenticity)由HPLC共洗脱和MS/MS分析证实(图2)。合成的CnIIIA随后用于不同的生物学分析。对小鼠偏侧膈收缩的作用在因直接刺激小鼠偏侧膈而诱导的肌肉收缩上评估CnIIIA的活性(图3)。在每种条件(缺乏或存在多种CnIIIA浓度)下,记录与250μs和各种强度的刺激相对应的收缩。这允许测定超大刺激强度,即得到最大收缩幅度所需要的强度。对于每个CnIIIA浓度,在肽施用至该制备物2小时后记录肌肉的收缩,以使毒素受体位点饱和。如图3A中所示,在100和300nMxa0CnIIIA的存在下,收缩的幅度降低,直至在600nMxa0CnIIIA时完全被抑制。通过比较,需要浓度至少2μM的μ-芋螺毒素GIIIA或GIIIB以便在相同条件下完全阻断同一种制备物。CnIIIA因此似乎比这种离体模型中所测试的现有μ-芋螺毒素的效果至少高少4倍。CnIIIA作用的剂量-反应曲线表明产生小鼠偏侧膈收缩的一半最大抑制的CnIIIA浓度是150nM(图3B)。当由刺激运动神经诱导肌肉收缩时,得到相似的结果(结果未显示)。对小鼠神经肌接头处的突触应答的作用为评估CnIIIA在肌肉和神经组织之间的作用选择性,在小鼠偏侧膈神经肌接头上施用600nMxa0CnIIIA后进行突触应答的细胞内记录。首先,结果显示纤维的膜静息电位与对照相比没有改变。这表明CnIIIA的去极化作用不会产生对肌肉收缩的抑制。其次,可以在CnIIIA的存在下检测到微终板电位(MEPP),因此表明烟碱乙酰胆碱受体的敏感性在产生肌肉收缩完全阻断的剂量下未改变。最后,在600nMxa0CnIIIA的存在下,神经刺激能够产生位相突触应答(phasicxa0synapticxa0response)。因此,类似于对照,可以记录到终板电位(EPP)。这表明神经传导在这个芋螺毒素浓度下没有改变。另外,细胞外电流记录允许检测到突触前电流,这反映运动神经末梢中存在突触前神经动作电位。也观察到因肌膜内阳离子突触通道的开放所致的突触后电流。对蛙神经肌肉制备物的肌动作电位和突触应答的作用研究了CnIIIA在蛙皮胸肌神经-肌肉制备物上的作用(图4)。在这种制备物中,通过甲酰胺处理容易地实现刺激-收缩的解偶联,因此允许细胞内记录由神经刺激而不是运动所诱导的肌动作电位。结果表明在2μMxa0CnIIIA的存在下,纤维的膜静息电位与对照相似。向制备物施用1μMxa0CnIIIA持续5-20分钟,引起由运动神经刺激所诱发的动作电位的幅度下降和持续时间增加。在25分钟后,肌动作电位完全被消除而仍能够记录到EPP。在更高浓度(2μM)的CnIIIA的存在下观察到相似的作用,不过出现得更快。应当指出的是,神经刺激和肌肉应答之间的潜伏期未显著地受芋螺毒素影响。与对照相比,施用CnIIIA(1和2μM)也不改变MEPP的幅度和频率。这些结果有力地表明,对通过芋螺毒素CnIIIA所产生得骨骼肌收缩的抑制因肌动作电位的偏好性阻断而产生,肌动作电位因此比神经动作电位对芋螺毒素更敏感。对小鼠坐骨运动神经的整体动作电位(GAP)的作用申请人优化了刺激的持续时间和强度,以获得代表组成神经的全部纤维的活性的GAP。对于给定的刺激持续时间(0.10、0.05或0.01毫秒),GAP幅度随着所施加的刺激强度(0.1-15V)的增加而增加,原因是被召集的神经纤维的数目增加。与等于或超过7V的刺激强度相对应,GAP幅度达到最大值,无论刺激持续时间多长(0.05或0.10ms)均保持恒定。这意味神经的全部纤维都对刺激作出应答。相反,0.01毫秒刺激不足以召集全部神经纤维,因为GAP最大幅度仅是在0.05或0.10ms刺激后所记录的GAP最大幅度的92%。为研究CnIIIA对GAP的作用,刺激的持续时间因而设定为0.05毫秒并且施加强度从0.1增加至15V。然而,为了证明我们的实验条件对研究的CnIIIA的任何浓度是最适合的,还以多种强度施加0.10毫秒刺激。在0.1-50μM的浓度范围内,发现CnIIIA降低GAP幅度,在神经用50μMxa0CnIIIA处理持续30-60分钟时,GAP幅度几乎达到零值(图5A,B)。此外,达到50%的GAP最大幅度所需的刺激强度随芋螺毒素浓度增加而增加(图5C)。最后,CnIIIA没有未显著调整GAP的传播速度。总之,这些结果结论性地表明μ-芋螺毒素CnIIIA通过降低各个神经纤维的应答而对小鼠坐骨神经发挥作用,而没有显著改变它们的膜兴奋性。CnIIIA对小鼠坐骨神经作用的剂量-反应曲线显示,1.53μM的芋螺毒素浓度使坐骨神经的最大GAP幅度降低了50%(图6)。这些数据显示运动神经对CnIIIA应答的敏感性比肌肉收缩对CnIIIA应答的敏感性低十倍。这些结果还表明μ-芋螺毒素比常见麻醉药如利多卡因在小鼠坐骨神经上的效果大约高1000倍。确实需要毫摩尔浓度的利多卡因以对小鼠坐骨神经得到相似的抑制剂作用。通过以下方式评价CnIIIA作用的可逆性:首先在多种浓度(2、10和50μM)的芋螺毒素的存在下记录坐骨神经的GAP,并且其次在将神经在无CnIIIA的哺乳动物林格氏液中浸泡多个时间段(从2小时至24小时)后记录坐骨神经的GAP。甚至在洗涤24小时后,仅观察到GAP幅度的轻微增加(图7)。为检验可逆性的缺乏是否可能因作为时间的函数的GAP幅度自发下降(“下降”现象)所致,将坐骨神经仅在哺乳动物克雷布斯-林格氏液中浸泡多个时间段(从2小时至24小时)后记录坐骨神经的GAP。在这些条件下,未观察到GAP幅度的明显调整。总之,这些数据有力地表明μ-芋螺毒素CnIIIA牢固地与小鼠坐骨神经上的受体位点结合,即芋螺毒素/受体复合体的解离发生得相当缓慢。对狗鱼嗅神经的整体动作电位(GAP)的作用欧洲狗鱼(白斑狗鱼)的嗅感神经含有大约五百万个相对均一(95%)的平均直径为0.20μm的无髓鞘轴突。这种神经具有高密度的轴突膜包装(axonalmembranexa0packing),并且因此是生物物理学、电生理学和药理学研究的特殊模型。先前已经报道用于记录组成这种感觉神经的全部纤维的GAP的最适条件(刺激的强度和持续时间)(Benoit等,2000)。强度和持续时间分别是8-9V和7-8ms的刺激召集嗅神经的全部纤维。在这种条件下,应答的最大幅度是2.77±0.15mV(n=37),并且以12±0.5cm/秒(n=37)的速度传播,其中所述的速度比由有髓鞘的轴突构成的坐骨神经中的速度慢60倍。因此,使用持续时间8毫秒和强度1-15V的刺激,研究CnIIIA对狗鱼嗅神经GAP的作用。当嗅神经用增加浓度的芋螺毒素处理时,观察到GAP幅度的降低,并且在施用10μM芋螺毒素30-60分钟时,可能记录不到GAP(图8A,B)。此外,与50%最大GAP幅度(即在15V上记录的)相对应的刺激强度随着芋螺毒素浓度的增加而增加。最后,CnIIIA没有显著调整GAP的传播速度(图8C)。总之,这些结果结论性地表明CnIIIA通过降低各个神经纤维的应答而对狗鱼嗅神经发挥作用,而没有显著改变它们的膜兴奋性。CnIIIA对狗鱼嗅神经作用的剂量-反应曲线显示0.15μM的芋螺毒素浓度使嗅神经的最大GAP幅度降低了50%(图9)。这些数据表明组成嗅感觉神经的无髓鞘的轴突的应答如小鼠肌肉一样对CnIIIA敏感(见图3B)并且对μ-芋螺毒素的应答敏感比组成坐骨运动神经的有髓鞘的轴突高10倍(见图6)。通过以下方式评价CnIIIA作用的可逆性:首先在多种浓度(1、2和10μM)的芋螺毒素的存在下记录狗鱼嗅神经的GAP,并且其次将神经在无CnIIIA的狗鱼林格氏液中浸泡多个时间段(从12小时至24小时)后记录狗鱼嗅神经的GAP。甚至在洗涤24小时后,也不能检测到GAP幅度的增加。为检验可逆性的缺乏是否可能因作为时间的函数的GAP幅度自发下降(“下降”现象)所致,将嗅神经仅在狗鱼林格氏液中在多种实验条件下浸泡后记录嗅神经的GAP:(i)在室温下实验腔室中持续30-60分钟(n=10)、(ii)在室温在狗鱼林格氏液中持续小于3小时(n=14)和(iii)在4°C在狗鱼林格氏液持续48小时(n=66)和持续72小时(n=46)。无论实验条件如何,均未观察到GAP幅度的明显调整。总之,这些数据有力地表明μ-芋螺毒素CnIIIA牢固地与狗鱼嗅神经上的受体位点结合,即芋螺毒素/受体复合体的解离发生得相当缓慢。CnIIIA在兔眼中的表面麻醉作用及其与利多卡因表面麻醉作用的比较在兔角膜上得到的结果表明浓度为2.5、5.0和10g/l的利多卡因的麻醉作用持续时间分别是5.3、14.2和22.3分钟。CnIIIA不仅在等摩尔基础上比利多卡因更有效,而且CnIIIA的作用持续时间更长,如图10中所示。CnIIIA的麻醉作用强度也比利多卡因更明显,其中所述的麻醉作用强度表述为施用至角膜表面直至再出现眨眼反射时刺激的总数。有趣的是,角膜反射在施用CnIIIA后恢复而没有出现可检测到的粘膜表面损伤。对通过膜片钳从HEK细胞中记录的钠电流的体外实验在稳定表达大鼠骨骼肌Na通道α亚单元(μl,Nav1.4)的HEKxa0293细胞中进行膜片钳电流记录(Yamagishi等,1997)。xa0xa0这些细胞表现强大的Na电流(>2nA),并且对蛤蚌毒素(STX)及衍生物敏感(Velez等,2001),并尺寸小(直径<20μm),允许合适地控制维持电位。在室温(20-22°C)下在稳定表达Nav1.4通道的HEKxa0293细胞上实施全细胞膜片钳记录(Hamill等,1981)。在填充有内部生理溶液时,由硼硅玻璃制成并在P-97拉针器(Sutterxa0Instrumentxa0Company,Novato,CA)上拉出的膜片吸管(patchxa0pipette)具有1.5-3.0MΩ的尖端电阻。使用Axopatchxa0200-B膜片钳放大器(Axonxa0Instruments,Unionxa0City,CA)记录膜电流。通过来自-100至-10mV维持电压的10-毫秒去极化脉冲来激发钠峰值电流。使用P/4方案来减去线性电容电流和漏电流。膜电流用集成8极低通贝塞尔(Bessel)滤波器在10kHz上过滤。过滤的信号由12比特的A/D转换器(Digidataxa01200B,AxonInstruments)数字化并使用pCLAMP软件(Axonxa0Instruments)存储。使用Origin7软件(OriginLabxa0Corp.,Northampton,MA)分析记录结果。细胞用含有如下成分的(单位mM)对照外部溶液以1ml·min^-1连续地灌注:70NaCl,70氯化四乙铵,5KCl,3CaCl₂,1MgCl₂,10mM葡萄糖,10HEPES(pH7.4)。膜片吸管含有(单位mM):140CsF,5NaCl,1MgCl₂,10亚乙基次氮基四乙酸(EGTA),10HEPES缓冲液(pH7.2)。在对照条件下和在以不同浓度的μ-芋螺毒素CnIIIA(μ-CnIIIA)或以二乙酸蛤蚌毒素(STX)(Sigma-Aldrichxa0Chemicalxa0Corp)灌注后记录Na电流。如一般实验中所示(图15),通过浴槽溢流而施加的μ-CnIIIA(50nM)阻断了由-100至-10mV去极化脉冲家族所激发的钠电流(图15A和15B)。如对浓度-反应数据拟合的S型非线性回归曲线所确定的,μ-CnIIIA以浓度依赖方式阻断钠电流。降低50%峰值钠电流(EC₅₀)的有效浓度是14.0nM。如图15C中所示,在μ-CnIIIA的存在下,钠峰值电流已经达到稳态水平后开始冲去(washout),并且在以无肽介质洗涤时没有被逆转。相反,STX对钠电流的作用在以不含STX的溶液灌注2-3分钟之内被彻底逆转。在一般实验中,μ-CnIIIA作用是持续存在的,而STX作用在从介质中冲洗出去时是可逆的。对小鼠的体内实验-趾外展评分(DAS)分析在成年(2-3月龄)雄性或雌性Swiss-Webster小鼠(20-40g)上实施这些实验。轻度麻醉的每只小鼠接受单次肌内注射50μL或100μL含有μ-CnIIIA或普鲁卡因的生理溶液至左后肢前外侧区域。注射后,通过使用DAS分析法(Aoki,2001)监测功能恢复。简而言之,通过尾巴使小鼠悬空以激发其中动物伸展后肢并外展后趾的特征性震惊反应。在注射μ-CnIIIA或普鲁卡因后,将左后肢和右后肢的趾外展程度作为时间的函数进行测定并由不了解处理的观察者依据5点量表(0=正常至4=趾外展和腿伸展的最大减少)评分。对小鼠的体内实验-握力评估轻度麻醉的每只小鼠接受单次肌内注射50μL含μ-CnIIIA或普鲁卡因的生理溶液至每个前肢的前外侧区域。使用与便携式计算机连接的小鼠握力计(600g量程;Technical和Scientificxa0Equipmentxa0GmbH,Badxa0Homburg,Germany)在注射前和在注射后的多个时间点上测量肌肉力量。本实验基本上如最初对大鼠所述的(Tilson&Cabe,1978)实施。简而言之,在尾基部固定小鼠并允许小鼠用两只前爪子抓牢滚动杆。随后温和地把小鼠向后拽直至小鼠松开前爪为止。将每次试验的峰值力量视为握力。每只小鼠进行三次试验,间隔约30秒。试验的平均值相对于对应的对照而表述,并用于分析(2-3只小鼠的均值±SEM)。结果(图12)显示,分别在肌内注射108-111皮摩尔μ-CnIIIA和22-26皮摩尔普鲁卡因每克小鼠后约5分钟和10分钟出现相对力量的50%降低。除了约快2倍出现外,麻醉作用在肽存在下也比在局麻药存在下更明显。在体内导致小鼠肌肉力量下降方面,肌内注射μ-CnIIIA至少比普鲁卡因更有效约5000倍。钠通道表达为在非洲爪蟾卵母细胞(X.laevis)中表达,将Nav1.4/pUI-2载体用NotI线性化并用T7xa0mMESSAGExa0mMACHINE试剂盒(Ambion)转录。对克隆通道的电生理学研究卵母细胞使用来自Drummondxa0Scientific(Broomall,PA)的微量注射器以1ng/nl的浓度注射50nlxa0cRNA。用于温育卵母细胞的溶液含有96mMxa0NaCl,2mMxa0KCl,1.8mMxa0CaCl₂,2mMxa0MgCl₂和5mMxa0HEPES,pH7.4,补充有50mg/l硫酸庆大霉素和180mg/l茶碱。使用受pClamp数据获取系统(Molecularxa0Devices)控制的基因钳(GeneClamp)500放大器(Molecularxa0Devices)在室温(18-22°C)进行双-电极电压钳(TEVC)记录。注射1日后记录来自卵母细胞的全细胞电流。电压电极和电流电极装有3Mxa0KCl。维持这两个电极电阻尽可能低。电解槽溶液组成是96mMxa0NaCl,2mMxa0KCl,1.8mMxa0CaCl₂,2mMxa0MgCl₂和5mMxa0HEPES,pH7.4。电流用4极低通贝塞尔滤波器在1kHz上过滤并且在5kHz上采样。使用-P/4方案进行泄露扣除((leakxa0subtraction)。在表达克隆的Nav1.4电压门控钠通道的卵母细胞中,通过从维持电位-90mV去极化至测试电位-10mV持续100毫秒而激发电流。脉冲频率是0.2Hz并且采样频率是20kHz。全部实验在室温进行。图14中所示的结果显示CnIIIA(500nM)阻断所表达的Nav1.4通道的能力。从这些实验中可以得出结论,即肽CnIIIA能够以所估计的1-50nM范围内的IC₅₀阻断电压门控钠通道Nav1.4同种型。肽-通道相互作用与其中结合速率呈浓度依赖性的生物分子反应兼容。最后,已经指出作用的可逆性很低。实施例3:CnIIIA与其它u-芋螺毒素的比较对小鼠指长伸(EDL)肌收缩的体外实验从通过颈椎脱位处死并随后立即放血的小鼠中分离EDL肌。将分离的肌肉设置在硅氧烷衬里的树脂玻璃浴槽(4ml容积)中,其中该述浴槽含有组成如下(单位mM)的标准克雷布斯-林格氏生理溶液:154NaCl;5KCl;2CaCl₂;1MgCl₂;5Hepes缓冲液(pH7.4);11葡萄糖。溶液供有纯O₂,。为测量抽搐张力,EDL肌的一个腱通过可调式不锈钢勾用丝线系扎于FT03等长传感器(Grassxa0Instruments,Astro-Medxa0Inc.,Westxa0Warwick,RI,USA),并且另一个腱用不锈钢大头针钉在硅氧烷衬里的浴槽上。通过用0.2毫秒持续时间和超大强度的电流脉冲以0.1Hz的频率直接刺激肌纤维而诱发抽搐,其中所述的电流脉冲由S-44刺激仪(Grassxa0Instruments,Astro-MedInc.,Westxa0Warwick,RI,USA)向沿着EDL肌放置的电极阵列供应。对于研究的每种制备物,调节静息张力以得到最大收缩反应并且在整个实验期间监测静息张力。来自等长传感器的张力信号借助配置有DT-2821模拟/数字界面板(Dataxa0Translation,Marlboro,MA,USA)的计算机进行放大、收集和数字化。计算机化的数据的获取和分析通过Johnxa0Dempster博士(Strathclyde大学生理学/药理学系(Departmentxa0ofxa0Physiology&Pharmacology),Glasgow,Scotland)提供的程序实施。全部实验在22°C下进行。制备物用含有10μM筒箭毒碱的充氧生理溶液平衡15分钟(旨在阻断烟碱型受体),将μ-芋螺毒素(CnIIIA、TIIIA、T3.1、PIIIA、SmIIIA或SIIIA)添加至介质中。为比较所研究的不同的μ-芋螺毒素对EDL肌的相对作用,在肌肉收缩上测试μ-芋螺毒素的相似浓度(即100nM)。当有可能时,在单个肌肉中产生浓度-反应曲线(在给定的μ-芋螺毒素的多种浓度存在下测量的收缩被表述为控制抽搐反应的百分数)。μ-芋螺毒素的每种浓度通过灌注而施用并且允许平衡45-60分钟。对浓度-反应数据的S型非线性回归曲线拟合允许估计使抽搐张力降低达50%的有效浓度(EC₅₀)。结果(图13)通过40分钟温育后与CnIIIA(100nM)进行对比而给出每种肽(100nM)的肌肉的相对平均收缩抑制率。为便于比较,CnIIIA已经归一化至100%。可以指出的是,全部肽SmIIIA、PIIIA和T3.1显示出的活性比CnIIIA低(下表)。表2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>对浓度-反应数据的S型非线性回归曲线拟合允许估计使抽搐张力降低达50%的有效浓度并且因此推导出每种肽的Kd(单位nM)。结果如下表所示。表3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>文献中公开μ-芋螺肽序列与CnIIIA[SEQxa0IDxa0N°2]的总结表4ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>Z和O分别代表焦谷氨酸和羟脯氨酸残基;^*指羧基酰胺化;虚线表示二硫键对。参考文献列表Amblardxa0M.etxa0al,2005,Methodsxa0Molxa0Biol.298,3-24Baker,M.D.andxa0Wood,J.N.,2001.Involvementxa0ofxa0Na+channelsxa0inxa0painpathways.Trendsxa0Pharmacol.Sci.1(22),27-31.Becker,S.,Atherton,E.,Gordon,R.D.,1989.Synthesisxa0andcharacterizationxa0ofxa0mu-conotoxinxa0IIIa.Eur.J.Biochem.1(185),79-84.Benoit,E.,Charpentierxa0G,Mateuxa0L,Luzzatixa0V,Kadoxa0R,2000.Thexa0pikeolfactoryxa0nerve:axa0sourcexa0ofxa0unmyelinatedxa0sensoryxa0axons.Cybium,Rev.Eur.Ichtyol.3(24),241-248.Bulaj,G.,West,P.J.,Garrett,J.E.,Marsh,M.,Zhang,M.M.,Norton,R.S.,Smith,B.J.,Yoshikami,D.,Olivera,B.M.,2005.Novelxa0conotoxinsxa0fromxa0Conusstriatusxa0andxa0Conusxa0kinoshitaixa0selectivelyxa0blockxa0TTX-resistantxa0sodiumxa0channels.Biochemistryxa019(44),7259-7265.Cruz,L.J.,Gray,W.R.,Olivera,B.M.,Zeikus,R.D.,Kerr,L.,Yoshikami,D.,Moczydlowski,E.,1985.Conusxa0geographusxa0toxinsxa0thatxa0discriminatexa0betweenneuronalxa0andxa0musclexa0sodiumxa0channels.J.Biol.Chem.16(260),9280-9288.Cruz,L.J.,Kupryszewski,G.,LeCheminant,G.W.,Gray,W.R.,Olivera,B.M.,Rivier,J.,1989.mu-conotoxinxa0GIIIA,axa0peptidexa0ligandxa0forxa0musclexa0sodiumchannels:chemicalxa0synthesis,radiolabeling,andxa0receptorxa0characterization.Biochemistryxa08(28),3437-3442.Decosterd,I.,Ji,R.R.,Abdi,S.,Tate,S.,Woolf,C.J.,2002.Thexa0patternxa0ofexpressionxa0ofxa0thexa0voltage-gatedxa0sodiumxa0channelsxa0Na(v)1.8xa0andxa0Na(v)1.9xa0doesxa0notchangexa0inxa0uninjuredxa0primaryxa0sensoryxa0neuronsxa0inxa0experimentalxa0neuropathicxa0painmodels.Painxa03(96),269-277.Fainzilber,M.,Kofman,O.,Zlotkin,E.,Gordon,D.,1994.Axa0newneurotoxinxa0receptorxa0sitexa0onxa0sodiumxa0channelsxa0isxa0identifiedxa0byxa0axa0conotoxinxa0thataffectsxa0sodiumxa0channelxa0inactivationxa0inxa0molluscsxa0andxa0actsxa0asxa0anxa0antagonistxa0inxa0ratbrain.J.Biol.Chem.4(269),2574-2580.Fainzilber,M.,Nakamura,T.,Gaathon,A.,Lodder,J.C.,Kits,K.S.,Burlingame,A.L.,Zlotkin,E.,1995.Axa0newxa0cysteinexa0frameworkxa0inxa0sodiumchannelxa0blockingxa0conotoxins.Biochemistryxa027(34),8649-8656.Finucanexa0B.T.,2005.Allergiesxa0toxa0localxa0anestheticsxa0-xa0thexa0realxa0truth.50:869-874.Canadianxa0Journalxa0ofAnesthesia(50),869-874.French,R.J.,Prusak-Sochaczewski,E.,Zamponi,G.W.,Becker,S.,Kularatna,A.S.,Horn,R.,1996.Interactionsxa0betweenxa0axa0pore-blockingxa0peptideandxa0thexa0voltagexa0sensorxa0ofxa0thexa0sodiumxa0channel:anxa0electrostaticxa0approachxa0tochannelxa0geometry.Neuronxa02(16),407-413.Gold,M.S.,Weinreich,D.,Kim,C.S.,Wang,R.,Treanor,J.,Porreca,F.,Lai,J.,2003.Redistributionxa0ofNa(V)1.8xa0inxa0uninjuredxa0axonsxa0enablesxa0neuropathicpain.J.Neurosci.1(23),158-166.Hill,J.M.,Alewood,P.F.,Craik,D.J.,1996.Three-dimensionalxa0solutionstructurexa0ofxa0mu-conotoxinxa0GIIIB,axa0specificxa0blockerxa0ofxa0skeletalxa0musclexa0sodiumchannels.Biochemistryxa027(35),8824-8835.Julius,D.andxa0Basbaum,A.I.,2001.Molecularxa0mechanismsxa0ofxa0nociception.Naturexa06852(413),203-210.Keizer,D.W.,West,P.J.,Lee,E.F.,Yoshikami,D.,Olivera,B.M.,Bulaj,G.,Norton,R.S.,2003.Structuralxa0basisxa0forxa0tetrodotoxin-resistantxa0sodiumxa0channelbindingxa0byxa0mu-conotoxinxa0SmIIIA.J.Biol.Chem.47(278),46805-46813.Kerr,L.M.andxa0Yoshikami,D.,1984.Axa0venomxa0peptidexa0withxa0axa0novelpresynapticxa0blockingxa0action.Naturexa05956(308),282-284.Lee,A.G.,1976.Modelxa0forxa0actionxa0ofxa0localxa0anaesthetics.Naturexa05569(262),545-548.McIntosh,J.M.,Olivera,B.M.,Cruz,L.J.,1999.Conusxa0peptidesxa0asxa0probesforxa0ionxa0channels.Methodsxa0Enzymol.(294),605-624.Moczydlowski,E.,Olivera,B.M.,Gray,W.R.,Strichartz,G.R.,1986.Discriminationxa0ofxa0musclexa0andxa0neuronalxa0Na-channelxa0subtypesxa0byxa0bindingcompetitionxa0betweenxa0[3H]saxitoxinxa0andxa0mu-conotoxins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.Axa014(83),5321-5325.Nielsen,K.J.,Watson,M.,Adams,D.J.,Hammarstrom,A.K.,Gage,P.W.,Hill,J.M.,Craik,D.J.,Thomas,L.,Adams,D.,Alewood,P.F.,Lewis,R.J.,2002.xa0Solutionxa0structurexa0ofxa0mu-conotoxinxa0PIIIA,axa0preferentialxa0inhibitorxa0ofpersistentxa0tetrodotoxin-sensitivexa0sodiumxa0channels.xa0J.Biol.Chem.xa030xa0(277),27247-27255.Olivera,B.M.,Cruz,Lxa0J.,de,S.,V,LeCheminant,G.W.,Griffin,D.,Zeikus,R.,McIntosh,J.M.,Galyean,R.,Varga,J.,Gray,W.R.,1987.Neuronalcalciumxa0channelxa0antagonists.Discriminationxa0betweenxa0calciumxa0channelxa0subtypesusingxa0omega-conotoxinxa0fromxa0Conusxa0magusxa0venom.xa0Biochemistryxa08xa0(26),2086-2090Olivera,B.M.,Gray,W.R.,Zeikus,R.,McIntosh,J.M.,Varga,J.,Rivier,J.,de,S.,V,Cruz,L.J.,1985.Peptidexa0neurotoxinsxa0fromxa0fish-huntingxa0conexa0snails.Sciencexa04732(230),1338-1343.Olivera,B.M.,McIntosh,J.M.,Cruz,L.J.,Luque,F.A.,Gray,W.R.,1984.Purificationxa0andxa0sequencexa0ofxa0axa0presynapticxa0peptidexa0toxinxa0fromxa0Conusxa0geographusvenom.Biochemistryxa022(23),5087-5090.Olivera,B.M.,Rivier,J.,Clark,C.,Ramilo,C.A.,Corpuz,G.P.,Abogadie,F.C.,Mena,E.E.,Woodward,S.R.,Hillyard,D.R.,Cruz,L.J.,1990.Diversityofxa0Conusxa0neuropeptides.Sciencexa04966(249),257-263.Ott,K.H.,Becker,S.,Gordon,R.D.,Ruterjans,H.,1991.Solutionxa0structureofxa0mu-conotoxinxa0GIIIAxa0analysedxa0byxa02D-NMRxa0andxa0distancexa0geometryxa0calculations.FEBSxa0Lett.2(278),160-166.Safo,P.,Rosenbaum,T.,Shcherbatko,A.,Choi,D.Y.,Han,E.,Toledo-Aral,J.J.,Olivera,B.M.,Brehm,P.,Mandel,G.,2000.Distinctionxa0amongxa0neuronalsubtypesxa0ofxa0voltage-activatedxa0sodiumxa0channelsxa0byxa0mu-conotoxinxa0PIIIA.J.Neurosci.1(20),76-80.Sato,K.,Ishida,Y.,Wakamatsu,K.,Kato,R.,Honda,H.,Ohizumi,Y.,Nakamura,H.,Ohya,M.,Lancelin,J.M.,Kohda,D.,.,1991.Activexa0sitexa0ofmu-conotoxinxa0GIIIA,axa0peptidexa0blockerxa0ofxa0musclexa0sodiumxa0channels.J.Biol.Chem.26(266),16989-16991.Sato,S.,Nakamura,H.,Ohizumi,Y.,Kobayashi,J.,Hirata,Y.,1983.Theaminoxa0acidxa0sequencesxa0ofhomologousxa0hydroxyproline-containingxa0myotoxinsxa0fromthexa0marinexa0snailxa0Conusxa0geographusxa0venom.FEBSxa0Lett.2(155),277-280.Scholz,A.,2002.Mechanismsxa0of(local)anaestheticsxa0onxa0voltage-gatedsodiumxa0andxa0otherxa0ionxa0channels.Br.J.Anaesth.1(89),52-61.Shichor,I.,Fainzilber,M.,Pelhate,M.,Malecot,C.O.,Zlotkin,E.,Gordon,D.,1996.Interactionsxa0ofxa0delta-conotoxinsxa0withxa0alkaloidxa0neurotoxinsxa0revealdifferencesxa0betweenxa0thexa0silentxa0andxa0effectivexa0bindingxa0sitesxa0onxa0voltage-sensitivesodiumxa0channels.J.Neurochem.6(67),2451-2460.Shon,K.J.,Olivera,B.M.,Watkins,M.,Jacobsen,R.B.,Gray,W.R.,Floresca,C.Z.,Cruz,L.J.,Hillyard,D.R.,Brink,A.,Terlau,H.,Yoshikami,D.,1998.mu-Conotoxinxa0PIIIA,axa0newxa0peptidexa0forxa0discriminatingxa0amongtetrodotoxin-sensitivexa0Naxa0channelxa0subtypes.J.Neurosci.12(18),4473-4481.Wakamatsu,K.,Kohda,D.,Hatanaka,H.,Lancelin,J.M.,Ishida,Y.,Oya,M.,Nakamura,H.,Inagaki,F.,Sato,K.,1992.Structure-activityxa0relationshipsxa0ofmu-conotoxinxa0GIIIA:structurexa0determinationxa0ofxa0activexa0andxa0inactivexa0sodiumchannelxa0blockerxa0peptidesxa0byxa0NMRxa0andxa0simulatedxa0annealingxa0calculations.Biochemistryxa050(31),12577-12584.West,P.xa0J.,Bulaj,G.,Garrett,J.E.,Olivera,B.M.,Yoshikami,D.,2002.Mu-conotoxinxa0SmIIIA,axa0potentxa0inhibitorxa0ofxa0tetrodotoxin-resistantxa0sodiumchannelsxa0inxa0amphibianxa0sympatheticxa0andxa0sensoryxa0neurons.Biochemistryxa051(41),15388-15393.Yu,F.H.andxa0Catterall,W.A.,2003.Overviewxa0ofxa0thexa0voltage-gatedxa0sodiumchannelxa0family.Genomexa0Biol.3(4),207